胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病机制复杂,其发生发展与特定基因 DNA 甲基化状态改变密切相 关。DNA 甲基化是化是目前表观遗传学中的研究热点,特定基因 DNA 的甲基化与胃癌的发生发展,诊 断治疗及预后密切相关。近年来,越来越多的研究结果显示原钙粘蛋白 10 (PCDH10)的表达缺失与胃癌, 结直肠癌及肝癌密切相关。本文拟通过对比胃癌组织与正常组织中 PCDH10 启动子区的甲基化情况,初 步探讨 PCDH10 的表达缺失与胃癌的发病关系。 2. 资料与方法 2.1. 对象及分组 收集青岛大学医学院附属青岛市市立医院普外科 2014 年 1 月~2015 年 1 月手术切除的胃癌肿瘤标本 100 例,标本均经病理科复核并确诊为原发性胃癌,其中男 50 例,女 50 例,平均年龄 53.76 岁 ± 11.89 岁。 2.2. 标本搜集及储存 胃癌组织取自癌灶中央非坏死区域,正常组织取自与之配对的距离癌组织 5 cm 以上区域,取后立即 置于 RNA 保存液中,−80℃冰箱保存,用于提取 DNA 和 RNA,入选患者术中均行淋巴结清扫,术前未 行放化疗,拥有完整的临床资料。 2.3. 检测指标及方法 组织 DNA 提取严格按照离心柱试剂盒(北京天根)操作说明书进行,保证提取的 DNA 无蛋白质及 RNA 污染。对 DNA 修饰后进行甲基化特异性 PCR (methy-lation specific PCR),提取 RNA 采用日本 TakaRa 公司的 RNA 提取试剂盒,提取后的 RNA 逆转录为 cDNA 保存于−20℃冰箱中,以进行 RT-PCR 反应。 反应引物为 PCDH10-F (bp120-GGCAAGTAACGGTGGAGATG.PCDH10-R(bp228C)-TCTCCGGATGGA TGTTCTTC (Invitrogen 英潍捷基上海贸易有限公司)。 2.4. 统计学处理 应用 SPSS17.0 软件包进行统计学处理,计数资料比较采用 χ2 检验,P 为双侧性检验,P < 0.05 认为 差异有统计学意义。 鞠亚菲,姜相君 47 3. 结果 胃癌组织与正常组织中 PCDH10 启动子区的甲基化情况:胃癌组织中启动子区甲基化率为 46.00% (46/100),明显高于正常组织 12% (12/100),差异有统计学意义(χ2 = 21.04, P < 0.05)。PCDH10 扩增曲线 熔解曲线见图 1,熔解曲线见图 2。在胃癌组织中,PCDH10 基因启动子区域的 DNA 甲基化导致了其基 因表达缺失,PCDH10 基因的甲基化状态与胃癌的发生有密切关系。 Figure 1. PCDH10 amplification curve 图 1. PCDH10 扩增曲线 Figure 2. PCDH10 dissociation curve 图 2. PCDH10 熔解曲线 Amplification Plot 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Legend A B C D E F G H 1,700,000 1,600,000 1,500,000 1,400,000 1,300,000 1,200,000 1,100,000 1,000,000 900,000 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0 -100,000 ΔRn Cycle A B C D E 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 F G H Temperature (˚C)Tm:81.23 Legend 690000.0 590000.0 490000.0 390000.0 290000.0 190000.0 90000.0 Derivative Reporter (-Rn') Melt curve 鞠亚菲,姜相君 48 4. 讨论 DNA甲基化是对 DNA 的一种化学修饰,主要发生于胞嘧啶[1] [2],通过甲基转移酶(DNA methyltransferance, DNMT)来实现[3] [4]。首先,DNMT 与 DNA 结合,将目标核苷酸反转暴露于 DNA 双螺旋 外,之后半胱氨酸的亲和基团与胞嘧啶第六位碳 C6 共价结合,从 S-腺苷甲硫氨酸 SAM 处转甲基至胞嘧 啶 C5 [5]上,从而形成甲基化状态。目前已有许多研究报道这两种之间的关系。Lou J [6]和 Fang JY [7] 等发现在胃癌组织中 c-myc 和 c-Ha-ras 基因甲基化水平降低,c-Ha-ras 基因低甲基化是胃腺细胞早期癌变 的一个重要遗传学事件。以往研究也证实了参与调节细胞周期的 p14,p15,p16,CHF,RIZI 基因,介 导细胞信号转导的 APC,PTEN,RASSF1,RUNX3,PDK1 基因;参与 DNA 修复的 hMLH1,MGMT, pS2 基因及抑制肿瘤扩散生长和转移的 E-cadherin,TIMP-3 基因存在高甲基化。 PCDH10 (原钙粘蛋白 10)是钙粘蛋白超家族成员,其 4q28.3 染色体区域在肝癌,结直肠癌,前列腺 癌,胰腺癌和乳腺癌中存在缺失。目前研究的热点集中于中枢神经系统方面,在消化道肿瘤方面的研究 较少。Zhong X 等[8]研究发现在 8 个结直肠癌细胞系中 PCDH10 基因启动子区 DNA 均表达沉默。Fang S 等[9]研究了 PCDH10 基因 DNA 发生甲基化后,在肝癌中的表达下降,并发现该基因可作为肝癌的筛查 基因之一。Li Z 等[10]发现在人胃癌组织中,PCDH10 表达量明显下降,且灵敏度较高,可作为筛查早期 胃癌的靶点之一。Yu B 等人[11]运用高分辨率熔解曲线技术对 100 例胃癌,100 例结直肠癌及 70 例胰腺 癌组织中的 PCDH10 基因 DNA 甲基化水平进行检测,发现其甲基化水平与肿瘤的发生密切相关。Yu J 等人[12]研究发现 PCDH10 作为一个肿瘤抑制基因,与胃癌的不良预后有极为密切的关系。 本实验表明,在胃癌组织中,PCDH10 基因启动子区域的 DNA 甲基化导致了其基因表达缺失, PCDH10 基因的甲基化状态与胃癌的发生有密切关系,更深层次的研究需在大样本的条件下进一步深入。——《临床医学进展》 |
1. 引言